Um novo mapa baseado em CRISPR liga cada gene humano à sua função Notícias do MIT

By | Junho 10, 2022

O Projeto Genoma Humano foi uma iniciativa ambiciosa para sequenciar cada parte do DNA humano. O projeto reuniu colaboradores de instituições de pesquisa de todo o mundo, incluindo o Instituto Whitehead de Pesquisa Biomédica do MIT, e foi finalmente concluído em 2003. Agora, mais de duas décadas depois, o professor do MIT Jonathan Weissman e seus colegas foram além e apresentaram o primeiro estudo funcional abrangente mapa de genes expressos em células humanas. Dados deste projeto, publicado on-line em 9 de junho estação, conecta cada gene com seu trabalho na célula e representa o culminar de muitos anos de colaboração no método de sequenciamento de célula única Perturb-seq.

Os dados são disponível para outros cientistas para uso. “É um ótimo recurso em termos de como o genoma humano é um ótimo recurso, porque você pode fazer pesquisas com base em descobertas”, diz Weissman, que também é membro do Instituto Whitehead e pesquisador do Howard Hughes Medical Instituto. “Em vez de definir com antecedência qual biologia você vai olhar, você tem este mapa genótipo-fenótipo e você pode entrar e navegar no banco de dados sem a necessidade de experimentação.”

A tela permitiu que os pesquisadores se aprofundassem em várias questões biológicas. Ele tem sido usado para estudar os efeitos celulares de genes com funções desconhecidas, estudar as respostas mitocondriais ao estresse e examinar genes que causam perda ou ganho de cromossomos, um fenótipo que se mostrou difícil de estudar no passado. “Acho que esse conjunto de dados permitirá todos os tipos de análises que ainda nem inventamos por pessoas vindas de outras partes da biologia e, de repente, eles só têm isso disponível para uso”, diz o ex-pós-doutorado Tom. Norman, um dos principais autores do artigo.

Pioneira Perturb-seq

O projeto se beneficia da abordagem Perturb-seq, que permite rastrear o impacto da inclusão ou exclusão de genes com profundidade sem precedentes. Este método foi publicado pela primeira vez em 2016 por um grupo de pesquisadores, incluindo Weissman e o colega professor do MIT Aviv Regev, mas só poderia ser usado em pequenos conjuntos de genes e com alto custo.

O vasto mapa Perturb-seq foi possível graças ao trabalho minucioso de Joseph Replogle, estudante de doutorado no laboratório de Weissman e co-autor deste artigo. Replogle, em colaboração com Norman, que agora dirige um laboratório no Memorial Sloan Kettering Cancer Center; Britt Adamson, professor assistente do Departamento de Biologia Molecular da Universidade de Princeton; e um grupo da 10x Genomics, partiu para criar uma nova versão do Perturb-seq que poderia ser aumentada. Pesquisadores publicaram um papel de prova de conceito dentro Biotecnologia da natureza em 2020.

O método Perturb-seq usa a edição do genoma CRISPR-Cas9 para introduzir alterações genéticas nas células e, em seguida, usa o sequenciamento de RNA de célula única para capturar informações de RNA expressas como resultado de uma determinada alteração genética. Como o RNA controla todos os aspectos do comportamento celular, esse método pode ajudar a decodificar muitos dos efeitos celulares das alterações genéticas.

Desde sua prova inicial de conceito, Weissman, Regev e outros usaram esse método de sequenciamento em menor escala. Por exemplo, pesquisadores usado Perturb-seq 2021 investigar como os genes humanos e virais interagem durante a infecção com HCMV, um herpesvírus comum.

Em um novo estudo, Replogle e colaboradores, incluindo Reuben Saunders, estudante de pós-graduação do Laboratório Weissman e coautor do artigo, estenderam o método para todo o genoma. Usando linhas celulares de câncer de sangue humano, bem como células não cancerosas derivadas da retina, ele executou Perturb-seq em mais de 2,5 milhões de células e usou os dados para construir um mapa abrangente ligando genótipos a fenótipos.

Mergulhando nos dados

Depois de completar a tela, os pesquisadores decidiram usar seu novo conjunto de dados e examinar várias questões biológicas. “A vantagem do Perturb-seq é que ele permite que você obtenha um grande conjunto de dados de maneira imparcial”, diz Tom Norman. “Ninguém sabe exatamente quais são os limites do que você pode obter com esse tipo de dados. Agora, a questão é: o que você está realmente fazendo com isso?”

A primeira e mais óbvia aplicação foi investigar genes com funções desconhecidas. Como a tela também lia fenótipos de muitos genes conhecidos, os pesquisadores puderam usar os dados para comparar genes desconhecidos com conhecidos e procurar resultados transcricionais semelhantes, o que poderia sugerir que os produtos dos genes agiam juntos como parte de um complexo maior.

De particular interesse foi a mutação de um gene chamado C7orf26. Os pesquisadores observaram que os genes cuja remoção levou a um fenótipo semelhante faziam parte de um complexo de proteínas chamado Integrator, que desempenhava um papel na produção de pequenos RNAs nucleares. O complexo Integrator consiste em muitas subunidades menores – estudos anteriores sugeriram 14 proteínas individuais – e os pesquisadores conseguiram confirmar que C7orf26 compilado por um 15. componente do complexo.

Eles também descobriram que 15 subunidades trabalham juntas em módulos menores para realizar funções específicas dentro do complexo do Integrador. “Sem essa visão da situação de uma altura de 300 metros, não ficou claro que esses diferentes módulos fossem tão funcionalmente diferentes”, diz Saunders.

Outra vantagem do Perturb-seq é que, como a análise se concentra em células individuais, os pesquisadores podem usar os dados para observar fenótipos mais complexos que ficam borrados quando estudados junto com dados de outras células. “Muitas vezes pegamos todas as células onde o ‘gene X’ foi derrubado e, em média, olhamos para elas juntas à medida que elas mudaram”, diz Weissman. “Mas às vezes quando você quebra um gene, células diferentes que perdem o mesmo gene se comportam de maneira diferente e esse comportamento pode ser perdido em média”.

Os pesquisadores descobriram que um subconjunto de genes cuja remoção levou a diferentes resultados de célula para célula é responsável pela segregação cromossômica. Sua remoção fez com que as células perdessem um cromossomo ou pegassem outros extras, uma condição conhecida como aneuploidia. “Você não poderia prever qual era a resposta transcricional à perda desse gene porque dependia do efeito secundário dos cromossomos que você ganhou ou perdeu”, diz Weissman. “Percebemos que poderíamos reverter isso e criar esse fenótipo composto procurando por assinaturas cromossômicas a serem ganhas e perdidas. Dessa forma, fizemos o primeiro levantamento genômico dos fatores necessários para a segregação adequada do DNA.”

“Acho que o estudo da aneuploidia é a aplicação mais interessante desses dados até agora”, diz Norman. “Isso afeta um fenótipo que você só pode obter lendo uma célula. Você não pode ir atrás de outra maneira.”

Os pesquisadores também usaram seu conjunto de dados para estudar como as mitocôndrias responderam ao estresse. As mitocôndrias, que evoluíram de bactérias de vida livre, carregam 13 genes em seus genomas. Dentro do DNA nuclear, cerca de 1.000 genes estão de alguma forma ligados à função mitocondrial. “As pessoas há muito se interessam em como o DNA nuclear e mitocondrial são coordenados e regulados em uma variedade de condições celulares, especialmente quando uma célula está sob estresse”, diz Replogle.

Os pesquisadores descobriram que, quando perturbam diferentes genes relacionados às mitocôndrias, o genoma nuclear reagia de maneira semelhante a muitas mudanças genéticas diferentes. No entanto, as respostas do genoma mitocondrial foram muito mais variáveis.

“A questão de por que as mitocôndrias ainda têm seu próprio DNA ainda está em aberto”, disse Replogle. “A grande conclusão do nosso trabalho é que uma das vantagens de ter um genoma mitocondrial separado pode ser uma regulação genética localizada ou muito específica em resposta a diferentes estressores”.

“Se você tem uma mitocôndria que está quebrada e outra que está quebrada de uma maneira diferente, essas mitocôndrias podem reagir de maneira diferente”, diz Weissman.

Os pesquisadores esperam usar o Perturb-seq em diferentes tipos de células no futuro, além da linhagem de células cancerígenas na qual eles começaram. Eles também esperam continuar pesquisando seu mapa de funções genéticas e esperam que outros façam o mesmo. “Este é realmente o culminar de muitos anos de trabalho de autores e outros colaboradores, e estou muito feliz em vê-lo continuar a ter sucesso e se expandir”, diz Norman.

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